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金黄色葡萄球菌的研究

时间:2020-09-03 08:28:47来源:本站

金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌,广泛分布于自然界,可以引起人和动物的感染。在人体主要寄殖于鼻前庭黏膜、腹股沟、会阴部和新生儿脐带残端等部位,偶尔也寄生于口咽部、皮肤、肠道及阴道口等,是医院感染常见的病原体之一。在医院里,耐甲氧西林和其他抗生素的金黄色葡萄球菌广泛流行,对万古霉素不敏感的菌株也有所增加,给临床治疗带来了很大的困难。金黄色葡萄球菌除了引起感染外,其产生的肠毒素可污染食物而致食物中毒,为人类带来非常严重的公共卫生负担。

病原学

1.1流行现状

院内感染及耐药:金黄色葡萄球菌是院内感染的常见细菌之一,许多国家都设有专门机构,应对金葡菌的院内感染问题。随着内酰胺类抗生素的广泛应用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)随之增加,且引起的感染和病死率有逐年增加的趋势。MRSA可通过接触途径进行传播,即易感人群从携带者或感染者身上获得MRSA,导致传播流行。

美国第一例MRSA发现于1968年,1975年MRSA在临床分离出的金葡菌中仅占2.4%,而1991年则迅速增至29%。美国的某些医院MRSA在临床分离出的金葡菌中可以占到30%-50%。同样在欧洲的葡萄牙和意大利,MRSA在临床分离出的金葡菌中占50%;土耳其和希腊0%。荷兰非常低,只有2%,这归功于荷兰行之有效的控制策略。在欧洲的调查中,瑞士的流行率最低(1.8%),这主要由于他们在医院内实行了一些新的干预行为,如坚持医护人员的手部卫生管理,以减少MRSA的传播。在北欧国家MRSA在临床分离出的金葡菌中不足1%。在芬兰MRSA是非常少见的,直到20世纪90年代医院的患者中只有散发的病例,近几年有报道由不同的流行株引起的医院感染暴发。同时,MRSA在社区感染中所占的比例也不断增加。1997年日本报道了第一例耐万古霉素的金葡菌(vancomycin-intermediatestaphylococcusau-reus,VISA),表明金葡菌的耐药问题日益严重。

金黄色葡萄球菌的研究


国内情况:上海地区1977-1979年MRSA占5%,1985-1986年占24%,1990年综合性大医院增至50%,而1993年则上升到60%。重庆地区1983-1985年为8.3%,1989-1992年上升为18.7%;1995年北京5家教学医院MRSA分离率平均为47%。广州地区1990-1995年临床分离的MRSA占金黄色葡萄球菌的比例分别为17.9%、23.5%、30.9%、41.6%、51.9%及56.18%。其他地区的报道也一般为25%-60%,各个地区和医院的MRSA检出率都明显有逐年增加的趋势。

食物中毒

由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的中毒暴发事件,近年来首推2000年日本“雪印奶粉”事件,14000多人受感染。根据日本卫生部公布的数字,日本20年期间(1980-1999)由金葡菌引起的食物中毒共有2525次暴发,包括59964人,3人死亡。

食物中毒的传染源,是被金葡菌感染的人和动物。如食品加工人员、炊事员或销售人员带菌,造成食品污染;食品在加工前本身带菌,或在加工过程中受到了污染,产生了肠毒素,引起食物中毒;熟食制品包装不严,运输过程受到污染;奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时,对肉体其他部位的污染。

引起的疾病

3.1化脓性炎症

3.1.1局部化脓性炎症金葡菌可以引起疖、痈、毛囊炎、蜂窝组织炎、伤口化脓、骨、关节的感染;也可以引起内脏器官感染,如肺炎、脓胸、中耳炎、心包炎、心内膜炎等,社区获得性金葡菌性支气管肺炎常见于老年人。本菌是脑室腹膜分流术后脑膜炎第二位最常见的病原。

3.1.2全身感染如败血症、脓毒血症等。

3.2毒素性疾病

3.2.1食物中毒:进食污染肠毒素食物后,经30min至8h潜伏期,即可出现恶心、呕吐、腹部疼痛和腹泻等急性胃肠炎症状,发病1-2天可自行恢复,预后良好。

3.2.2烫伤样皮肤综合症:感染产生表皮溶解毒素的金葡菌所致。多见于新生儿和幼儿及免疫功能低下的成人,患者皮肤呈弥漫红斑、起皱、继而形成水疱,至表皮脱落。

3.2.3中毒性休克综合症:主要表现为高热、低血压、红斑皮疹伴脱屑和休克等,半数以上患者有呕吐、腹泻、肌痛、结膜及黏膜充血、肝肾功能损害等,偶尔有心脏受累的表现。

3.2.4假膜炎肠炎:假膜炎肠炎本质是一种菌群失调性肠炎,病理特点是肠黏膜被一层炎性假膜所覆盖,该假膜由炎性渗出物、肠黏膜坏死块和细菌组成。人群中10%-15%有少量金葡菌寄居于肠道,当优势菌如脆弱类杆菌、大肠杆菌等因抗菌药物的应用而被抑制或杀灭后,耐药的金葡菌就乘机繁殖而产生毒素,引起以腹泻为主的临床症状。

分型

4.1表型分型

4.1.1血清学分型:本方法是根据金葡菌的特异性抗原进行分型,首先制备一系列特异抗血清,再与待测菌株进行凝集反应,依据不同凝集形式分型。但由于金葡菌分布广泛,抗原复杂,交叉多,免疫血清效价普遍低,而且还存在一些菌群特异性抗原如A蛋白的非特异凝集的干扰,所以制备分型血清比较困难。

4.1.2噬菌体分型:噬菌体分型方法,可以将金葡菌分为5群,26型。噬菌体分型在流行病学调查时追踪传染源及研究菌型与疾病种类间的关系上均有重要意义。如肠毒素型食物中毒主要由III群菌株引起;医院中严重败血症流行株常为I群中的52,52A,80,81型菌株;引起表皮剥脱性皮炎的菌株多属II群71型。此方法重复性好,且不需特殊设备和试剂,但其分辨率在80%左右,还有一些常见型需进一步分出亚型。此外,如无其他流行病学证据,噬菌体分型本身不能作为判断菌株相关性的绝对鉴定指标。

4.1.3耐药谱分型:用一系列抗生素对金葡菌做药敏实验,根据不同的耐药谱分型。此方法成本低,操作简便,判定结果容易,所以应用广泛。耐药谱分型缺点是金葡菌耐药性强,相同耐药谱却有不同的基因型或噬菌体型,即该法分辨率差;另一缺点是耐药标志物由可移动基因(如质粒)携带,质粒的丢失或获得会改变耐药谱,故稳定性差。

4.1.4凝固酶分型:根据抗凝固酶兔血清体外中和试验将金葡菌凝固酶分成8个型(I~VIII型)。在日本凝固酶分型被成功用于金葡菌引起的食物中毒的流行病学调查。有报道发现,来自金葡菌烫伤皮肤综合征、脓肿、脓疱的分离株分别以I、IV、V型占优势,而来自食物中毒的菌株以II、III、VI或VII型多见。本法简便易行,分型率高,但分辨力不强,在流行病学研究中可作为经典方法的补充。

4.2基因分型

4.2.1质粒和质粒限制性内切酶图谱:金葡菌含有数种大小和数目不等的质粒,在一定时间内,这种质粒特征保持相对稳定,可根据质粒大小和数目分型(质粒图谱,plasmidprofile)。分析不同来源的金葡菌含有分子量接近的质粒,尤其只含一种质粒时,可用限制酶消化质粒,根据酶切片段的大小和数目来进一步鉴别其相关性(质粒指纹图谱,plasidfingerprinting)。这种方法具有区分能力强,结果稳定的特点,可以区分流行株和非流行株,但对于质粒丢失及发生基因重组的菌株不能准确分型,因此,最好是尽快在限定时间内检测质粒。

4.2.2PFGE分型:金葡菌DNA经限制性内切酶(SmaI、CspI)消化后,可获得5-20条片段(10-700kb),根据电泳条带的不同形式对其分型。PFGE分型在辨别能力,分型和重复性方面具有其他分子分型所不具有的优势,所以被认定为金葡菌分型的金标准。它已经被广泛用于金葡菌的医院感染和甲氧西林抗性的流行病学调查。其缺点主要在于需特殊仪器,费时太长且过程繁琐。

4.2.3核糖体分型:核糖体分型属于探针分型。核糖体核糖核酸(rRNA)基因是细菌进化过程中最为保守的基因,在细菌染色体上可存在多个拷贝,以rRNA的基因片段为探针可检出含rRNA的DNA片段。金葡菌染色体DNA经限制酶切消化后,经琼脂糖凝胶电泳分离,然后与细菌rRNA探针杂交,根据杂交条带的数目和大小不同鉴别菌株。本方法分型率高,分辨力强,重复性好,结果判定容易(杂交带一般较少,肉眼即可辨别)但技术复杂,难以普及。

4.2.4随机引物PCR扩增产物的多态性(RAPD):1990年Welsh和McClelland以及Williams等同时创立随机扩增DNA多态性分析和AP-PCR。它与传统标准PCR的不同之处是采用随机引物进行扩增,随机引物是根据革兰阴性肠杆菌科细菌的重复序列而设计的,这些引物能检测金葡菌DNA可变区。首先选择随机的寡核苷酸引物,一般选择2~3条引物,一条引物难以有效辨别不同菌株,通过增加引物数量,可对任何复杂的生物变异进行基因分析,但引物条数越多,操作越复杂。然后在较低的温度下启动新链合成,从而产生具有型、株特异性的DNA扩增片段,经电泳后根据其产生的不同条带对细菌分型。Cetinkaya等用此方法对外科暴发流行的MRSA进行分型研究,证实AP-PCR是一种简单快速的分型方法。该方法无需了解待测基因组的碱基序列,不受DNA限制性内切酶的限制,具有敏感、快速、重复性好的优点,但不同实验条件对结果有影响,因此必须对实验条件进行严格控制,确定最佳反应条件。

4.2.5MLST:MLST是一种高分辨力的分型方法。金葡菌内部的7个基因为arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqiL,其基因片段长度分别为456bp、456bp、465bp、429bp、474bp、402bp、516bp,在不同菌株,每一片段由于不同的等位基因而有不同的序列。用7对引物扩增7个基因,再测序扩增产物,与www.mlst.net上公布的相应基因的等位基因进行比较,获得该菌株针对7个持家基因的等位基因谱;提交MLST网站,确定金葡球菌临床分离株的序列分型(Sequencetype,ST),并与国际菌株的资料进行比较,从而鉴定是一种新的型别还是原有型别。MLST适合长期大范围的流行病学调查研究。但由于是根据基因序列进行分型,少数核苷酸序列的不同就会导致型别不同,因此技术要求严格。

4.2.6特异功能集团基因的多态性分型

4.2.6.1凝固酶基因多态性:由于编码不同凝固酶的基因序列不同,根据凝固酶基因序列设计引物扩增其可变区,再用内切酶消化PCR产物,由于可变区多态性导致PCR产物不同。最后根据消化产物电泳长度多态性分析菌株间关系。

4.2.6.2蛋白A基因多态性:编码蛋白A的基因spa含有几种不同的功能区,此方法主要针对Fc结合区和X区,前者含有2~5个重复序列,每个序列长为160bp,后者含有最多可达15个长为24bp的重复序列,X区由于重复序列数目不同而具有高度的多态性。根据spa基因序列,设计引物对spa内的这两个功能区进行选择性扩增,扩增产物具有多态性,酶切后产生不同的电泳图谱,从而对不同的菌株分型。

4.2.6.3mecA基因高变区(HVR)长度多态性:此方法只适合MRSA菌株分型,在金葡菌染色体上,位于耐药决定基因mecA和一端类似插入序列因子IS431之间存在着一段长约204bp的基因高变区,它在不同的MRSA菌株中呈现出不同长度的不同片段,其长度多态性主要是由一个直接重复单位的序列不同而引起,根据这个重复单位序列扩增产物多态性分型。因此在HVR长度多态性的基础上,可以用PCR扩增方法来区分不同的MRSA菌株。它可把MRSA分为5型。

任何一种分型方法都不能单独作为菌株相关性判断的绝对指标,必须结合其他流行病学资料,根据现实情况的需要,选择两种或更多的有效方法来鉴别菌株,以提高分型率、分辨力及结果的可靠性,为控制金葡菌感染提供详实的流行病学资料。

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