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黄金色葡萄球菌检验方法

时间:2020-09-07 08:59:06来源:本站

金葡菌的检测根据细菌的分离培养、染色观察、血浆凝固酶试验、氧化酶试验、耐药性检测即可作出初步的判断。下面介绍一些分子生物学和快速检测方法。

一、分子生物学的检测方法

1.1传统PCR方法:

核酸扩增技术,即聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR),其基本原理是设计、合成两条寡核苷酸,作为引物,对应于待测病原微生物某一段特异性序列的两端,然后在体外模拟DNA体内复制的过程反复扩增,使靶序列放大上万倍甚至上百万倍而被检测出来。

传统PCR方法检测金葡菌的特异基因,如耐热核酸酶基因(nuc);检测金葡菌的保守基因16S RNA;用多重PCR方法可在较短的时间内检测金葡菌的多种毒素基因,如肠毒素A-E(entA,entB,entC,entD,entE),表皮剥脱毒素A和B(eta,etb),中毒性休克综合征毒素(tst)。

1.2荧光PCR:荧光PCR技术在普通PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累检测整个PCR反应的过程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量。Deurenberg用Real-timePCR检测金葡菌的tst基因,作为分子流行学的一种有效的监测手段。

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实验步骤

1.试剂配制(试剂准备区)

从试剂盒中取出PCR反应液在室温融化,并充分震荡混匀,所有试剂在使用前2000rpm离心10s。设所需要的管数n(n=样本数+1管阳性对照品+1管阴性对照品),每个测试反应体系试剂配置如下表。计算所需要的n管反应的各试剂的使用量,加入至适当体积的无菌离心管中,充分混合均匀,分装至无菌PCR反应管中,每管22μl;

2.PCR扩增(扩增和产物分析区)

将样本、阴性对照品和阳性对照品使用前恢复至室温,2000rpm离心10s。向每个PCR反应管中加入3μl模版(样本、阴性对照品或阳性对照品),震荡混匀,于2000rpm离心10s。将PCR管放入PCR仪中,使用以下程序进行扩增反应,整个扩增反应约需2小时;

3.结果判断(扩增和产物分析区)

PCR管中取出2μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。在紫外灯下,阴性参照品没有任何条带;金黄色葡萄球菌阳性参照品具有大小为566bp的条带。当被检样品经电泳检测出现566bp的条带则判定金黄色葡萄球菌阳性,当未出现条带或所出现的条带大小与阳性参照品的条带大小不一致时均视为阴性结果。


黄金色葡萄球菌检验方法


二、快速检测方法

2.1StaphychromII实验:由显色底物,人凝血酶原和蛋白酶抑制剂组成的StaphychromII实验,是一种快速,可靠,易操作的检测方法,可在2h得到结果。Nathalie等人将该方法与凝固酶试管凝集实验和乳胶凝集实验做了比较,对293株从临床分离的菌株进行检测,StaphychromII实验的敏感性,特异性,阳性预测值和阴性预测值分别为98.1,100,100和95.1%;乳胶凝集实验为98.6,98.7,99.6和96.3%,试管凝集实验为97.6%,98.7%,99.5和93.9%。证明该方法具有与乳胶凝集实验相同的敏感性,具有100%的特异性。但该方法较昂贵,不易在基层单位推广。

2.2金黄色葡萄球菌鉴别培养基:商业化的金葡菌显色培养基,仅需通过单一菌落的典型色彩即可进行初步鉴定,大大提高了对金葡菌的检出率。S.aureusID培养基,法国科玛嘉干粉显色培养基和Baird-Parker+RPF培养基(生物梅里埃公司)都属于同类产品,可通过特殊的菌落颜色,在18-20h对金葡菌进行初步鉴定。Perry用S.aureusID培养基,法国科玛嘉干粉显色培养基和传统培养基对金葡菌的分离培养进行比较,证明S.aureusID培养基对于金葡菌的分离和鉴定,是一种敏感性和特异性很高的培养基。

2.3金黄色葡萄球菌快速测试片法

原理:该测试片由两部分组成,第一部分是金黄色葡萄球菌培养基片,此检测片含有改良的Baird-Parker营养物及一冷水可溶的胶体,第二部分是热稳定核酸酶(Tnase)反应片,包含有DNA,甲苯胺蓝(toluidineblue-O)及四唑指示剂(tetrazolium),此指示剂有助于菌落的计数及确定葡萄球菌热稳定核酸酶的存在。

2.4金黄色葡萄球菌乳胶凝集试验:作为免疫学方法之一,乳胶凝集试验在金黄色葡萄球菌的检测分析中,既可用作初筛,同时也是确认方法之一。这一类的产品也很多,包括生物梅里埃公司的SlidexStaph-kit等。

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